基于杆状病毒的 AAV 生产
尽管已上市的第一个 AAV 基因治疗产品 uniQure 的 Glybera (alipogene tiparvovec) 是使用杆状病毒系统生产的，但该平台主要针对治疗性蛋白质的生产进行了优化。行业已经开发了一种 BEVS 生产系统，用于生产规模为 21,000 L 的含有流感血凝素的疫苗。与基于 HEK293 的方法相比，杆状病毒介导的 AAV 生产还不太成熟，尽管大约在二十年前就已首次引入，但临床上的产品较少。与 AAV 等病毒载体相比，单一重组蛋白的生产复杂性较低，而对于前者，五种蛋白质（VP1、VP2、VP3、Rep78 和 Rep52）和单链 DNA 分子必须以最佳水平表达并正确组装。
最佳 AAV 生产需要将哺乳动物病毒 (AAV) 分子翻译到培养的昆虫细胞中。AAV 需要剪接才能正确表达其 VP1、VP2 和 VP3 衣壳蛋白及其 Rep78 和 Rep52 亚型。遗传序列已经进化以确保最佳剪接并随后AAV结构成分在哺乳动物细胞中的正确化学计量。不幸的是，这些过程并没有在昆虫细胞中以最佳方式发生，除其它外，天然存在的病毒启动子需要被在杆状病毒感染细胞中具有活性的启动子取代。因此，需要进行分子修补，以确保生产完全包装且有效的 AAV 颗粒。如果不对病毒基因进行适当的分子工程、以符合昆虫细胞表达，所产生的病毒将呈现不正确的衣壳化学计量（通常存在过多的 VP1），并且完整衣壳的百分比将会很低。图 3 中的示意图描述了迄今为止不同代的杆状病毒生产系统。
图 3：基于杆状病毒的 AAV 生产系统的历史示意图，第一个系统于 2002 年推出，其中包含三种杆状病毒，分别包含目的转基因、cap 基因和 rep 基因。cap 基因置于杆状病毒多角体蛋白 (polH) 启动子的控制之下。rep 同种型 Rep52 和 Rep78 在 polH 启动子 (Rep52) 和 Orgyia pseudotsugata (OpMNPV) (Rep78) 的 Δ 立即早期 1 启动子的控制下分成两个独立的表达盒。第二代系统通过 Smith和Chen等人描述的策略将 cap 和 rep 结合在单个杆状病毒中。后来，Galibert 等人开发了一个 Monobac 系统，在单个杆状病毒中包含所有三个元素（cap、rep 和转基因）。Aslanidi等人后来开发了稳定表达 cap 和 rep 基因的 Sf9 源性包装细胞系。使用这些系统生产 AAV 只需要感染一种表达转基因的杆状病毒。
在第一代 BEVS 中，rep 转录本在不同启动子的控制下被分成两个盒，并且 cap 编码序列被改变，以包含一个非规范的起始密码子（ACG 而不是 AUG），以实现正确的 AAV 衣壳化学计量和基因组包装。基因改变的 AAV 序列被克隆到三个单独的杆状病毒构建体中，这些构建体含有 cap、rep 或两侧为 AAV ITR 的转基因。为了有效地生产 AAV，单个细胞需要同时感染三种不同的杆状病毒。虽然该“Three-Bac”系统成功应用于重组AAV血清型1的生产，但无法应用于其它AAV血清型的生产。
第二代 BEVS 克服了 AAV 血清型的限制，并将 AAV 生产所需的杆状病毒数量减少到两种：携带 cap 和 rep 基因的 Bac–CapRep 病毒和携带 AAV DNA 基因组的 Bac–Transgene。此外，引入了不同的分子适应性，以实现 AAV 基因的正确表达。例如，Kondratov 等人使用衰减 Kozak 序列和漏核糖体扫描来实现 AAV5 和 AAV9 衣壳蛋白的正确化学计量。该团队重新设计的 AAV 载体比 HEK293 生产的载体表现出更高的生物学效能。
确保正确的 AAV 化学计量 - 从而以高产量生产有效载体的另一种策略是在 AAV 序列中插入人工内含子。Chen等鉴定了一个杆状病毒源性的内含子，他们在其中放置了杆状病毒多角体蛋白 (polh) 启动子。将人工内含子引入 (AAV) rep 和 cap 基因，以增强转录，从而增强 VP2/3 和 Rep52 的表达水平。由此产生的 AAV（各种血清型）具有传染性且滴度高（高达 10^14 vg/L）。
BEVS 系统的最新发展包括将 AAV 生产所需的重组杆状病毒数量进一步减少到只有一种重组病毒。Galibert等人通过将所有三个 AAV 基因（rep、cap 和侧翼为 AAV ITR 的转基因）插入一个“Monobac”杆状病毒中来实现这一点。Aslanidi等人制备了杆状病毒感染诱导型草地贪夜蛾 (Sf9) 包装细胞系，细胞基因组中含有 AAV rep 和 cap 基因。用两侧携带有 AAV ITR 的转基因的单个杆状病毒感染该包装细胞系，导致产生比第一代 Three-Bac 系统更高产量的 AAV 颗粒。
如果不对 AAV 基因进行适当的分子工程、以符合昆虫细胞表达，则产生的病毒将具有不正确的衣壳化学计量和较低百分比的完整衣壳。此外，不正确的 Rep52 和 Rep78 表达时间和水平将导致在 AAV 衣壳中包装更多残留（宿主和杆状病毒）DNA。因此，在表征杆状病毒生产系统的 AAV 颗粒时，了解使用哪种特定表达系统始终很重要。这极大地影响了 AAV 载体的特性，例如传染性、效力、包装和可生产性。
与 BEVS 相关的 AAV 生产的另一个挑战是杆状病毒载体本身固有的遗传不稳定性。杆状病毒在病毒复制过程中自然切除其部分基因组，以形成突变病毒，这些病毒可能成为有缺陷的干扰颗粒。在后续需要扩大规模的细胞培养传代过程中，这些突变体的生长速度可能超过具有全长基因组的杆状病毒。
与 AAV 基因表达和剪接不当一样，分子工程可以在很大程度上克服杆状病毒遗传不稳定性。通过删除某些基因或通过将转基因插入基因组中特定的稳定位点，可以使杆状病毒基因组更加稳定。此类策略尚未针对 AAV 表达进行充分探索。一旦杆状病毒载体和 AAV 基因的分子设计得到优化，生物生产商将受益于 BEVS 平台的许多积极特性，以大规模、稳健地生产 GMP 级生物药。
原文：F.Hoeksema, H.van der Schaar, P.Puri, et al., Large-Scale AAV Production: Advantages of an Insect-Cell Baculovirus Expression Vector Platform. Bioprocess Insider, 2023.
