加速腺相关病毒 (AAV) 生产的规模放大是非常可取的，以满足对基因疗法日益增长的需求。然而，用于 AAV 基因疗法的生物工艺的开发仍然耗时且具有挑战性。质量源于设计 (QbD) 方法可确保生物工艺设计满足所需的产品质量和安全性。快速压力测试、可开发性筛选和规模缩小技术有可能在 QbD 框架内简化 AAV 产品和生物工艺的开发。在这里，我们将回顾它们在抗体生产开发中的成功应用如何转化至 AAV，以及这将如何在很大程度上取决于改进的分析方法和工具的适应性，因为人们对成功的疗法开发所需的 AAV 关键属性有了更多的了解。

基于 AAV 的基因疗法的迅速崛起

先进疗法的快速开发为肿瘤和罕见病的治疗提供了新的可能性。其中，基因疗法最近在临床上取得了成功，显示出了特别的前景。基因疗法的治疗效果是通过操纵基因序列或递送遗传物质来实现的，迄今为止，已针对多种疾病进行了开发，包括自身免疫性疾病、神经系统疾病、视网膜疾病和各种类型的肿瘤。一些现已获得监管机构的批准，代表了基因治疗发展的重要新里程碑。图 1 所示的时间表总结了部分已批准疗法的发展。

图 1. 截至2019年细胞和基因治疗批准的时间表及其目标适应症（基因治疗，黑色；基于细胞的基因治疗产品，蓝色）。

遗传物质的递送通常需要将它们掺入病毒或非病毒基因递送载体中，例如脂质纳米颗粒、腺病毒或 AAV。本文重点关注 AAV（图 2A），它是细小病毒家族的一员，也是一种广泛用于基因治疗和疫苗的病毒载体，因为它具有广泛的细胞嗜性和低免疫原性。野生型 AAV 的基因组包含三个基因，rep、cap 和 aap（图 2B），分别编码关键病毒复制蛋白、衣壳蛋白（VP1、VP2 和 VP3）和组装激活蛋白。

图 2. 腺相关病毒 (AAV) 血清型 2 的结构和基因组。

迄今为止，已在人类（AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6 和 AAV9）和非人灵长类动物中发现了 150 多种 AAV 基因型和 13 种血清型，而在其它物种中发现了更多。它们在细胞嗜性和转导效率方面有所不同，从而导致不同的功能。

必须修改 AAV 基因组、以使其适合临床应用。野生型 AAV 可以整合到宿主基因组中，产生永久性和潜在可遗传的基因修饰，这会给患者带来重大风险。这些风险已在临床使用的重组 AAV (rAAV) 中消除，方法是用目的治疗基因替换 rep 和 cap 基因中的一个或两个，并将移除的基因置于仅在 AAV 生产期间使用的单独质粒上。因此，新的 AAV 颗粒仍然具有感染性，但无法将完整的 AAV 基因组插入人类宿主染色体，并且无法在“野外”或注射到人体后进行复制。

本文将概述如何使用 QbD、缩小规模、超缩小规模 (USD) 和压力测试等各种工具来加速 AAV 生物工艺的开发。我们还将总结当前可用于 AAV 表征和生物工艺质量控制的分析工具面临的挑战。

加速生物工艺开发的工具

随着临床管线的扩大，对 AAV 的需求正在迅速增长，这使得对平台化大规模 AAV 生产工艺的需求比以往任何时候都更加迫切。它们的生产很复杂，需要细胞扩增、转染、细胞培养、病毒收获以及多个纯化和缓冲液置换步骤。由于 AAV 固有的不稳定性和复杂的生物学特性，以及能够告知要实现的理想产品属性的长期临床数据相对较少，因此开发和放大 AAV 生产工艺非常耗时且具有风险。它们的开发还建立在相对较少的先例之上，并且缺乏 AAV 特异性生物工艺、细胞系和分析仪器的技术成熟度优势，而这些优势在更成熟的平台（如抗体）中已基本建立。随着进一步的开发工作提高了单个 AAV 生产步骤的工艺强度，这些挑战将继续演变多年。

预计有几种实验工具能够加速 AAV 产品制剂和早期工艺开发。这些建立在它们在单克隆抗体 (mAb) 开发方面取得的公认成功的基础上，并且按大致的实施顺序可包括：(i) 候选产品的可开发性筛选；(ii) 用于快速生物工艺开发的缩小和超缩小工具；(iii) 用于快速制剂的加速（强制）降解筛选。

这些工具中的每一个都被设计为在各自的开发阶段使用，以加速可生产产品候选物的选择，优化生产过程，或用于快速开发稳定的剂量配方。因此，可以提高效率，例如，通过设计可开发性筛选来生成生物物理数据，这些数据可以更好地为最终产品制剂和保持稳定产品的生物工艺参数操作窗口提供信息。mAb 的设计、生产和制剂逐渐集中在一些稳健的平台方法上。这进一步限制了条件的搜索空间，并导致在用于这三种工具的许多实验条件中出现更大的重叠。相比之下，AAV 的平台生产方法还没有足够的时间来完全开发，因此，使用这三种工具测试的条件也在不断发展。

有助于塑造用于加速 mAb 开发的工具的另一个特征是 QbD。通过了解工艺参数如何影响产品特性并最终影响其临床性能，行业鼓励采用这种方法来降低生物制品生产工艺开发和规模放大的风险。如图 3 所示，该方法将关键质量属性 (CQA) 定义为易于测量的生物物理和物理化学产品特性，以确保达到质量目标产品概况 (QTPP) 中定义的所需临床性能；关键材料属性 (CMA) 和关键工艺参数 (CPP) 被确定为可能会显著影响 CQA 的因素，如果它们发生变化。因此，前面定义的三个实验工具有可能识别 CMA 和 CPP，甚至量化它们的边界。

图 3. 质量源于设计 (QbD) 框架的工作流程。

mAb 的平台生产方法和来自许多产品的大量临床数据意味着现在可以相对快速地定义它们的 CQA。相比之下，随着更多产品生成临床数据，AAV 的 CQA 可能会继续扩大。这也可能导致使用此处描述的三种工具进行测试和测量的条件范围发生变化。

用于 AAV 生产生物工艺开发的规模缩小和超缩小工具

规模缩小的平台使用与中试到大规模生产相同的工艺单元操作，并通过足够严格的控制来实现高可再现性，但操作体积要小得多，通常可以并行运行，以快速探索和优化工艺变量。生产工艺的早期中试规模优化可在很大程度上提示 CMA 和 CPP 的可接受设计空间以及将它们维持在设计空间中的潜在控制策略。因此，可以将规模缩小的平台扩展到对生物工艺操作参数的更广泛探索，从而提供更深入的了解。

这种方法现在已经很好地用于 mAb 生物工艺开发，尽管产品之间也存在显著差异，但某些方面可以很容易地转移到 AAV 中。例如，ambr（Sartorius）等小型化生物反应器可以提供与大型生物反应器相当的细胞培养性能、环境控制性能和抗体生产率，使其适合作为大规模细胞培养/发酵的预测工具。使用 24 孔板的缩小方法已被用于优化悬浮培养中慢病毒载体的生产，因此具有成功生产 AAV 的良好潜力。

其它强大的规模缩小的系统，如微型层析柱和微升批次孵育，也被广泛用作层析条件和填料选择的高通量筛选方法。这些规模缩小的平台已经在抗体领域建立了良好的基础，并且已经被用于加速 AAV 生物工艺的开发。当然，AAV 的具体筛选条件会有所不同，甚至可能在血清型之间也会有所不同，如 AAV 阴离子交换层析的洗脱电导率和 pH 值等 CPP会影响空-完整衣壳分离性能。

与规模缩小相比，超缩小（USD）工具不会复制小规模操作的工艺，而是旨在仅使用毫升样品、精确模拟大规模工艺操作单元中遇到的临界条件。它们可用于优化产品、溶液条件或生物工艺参数，并为每个操作单元定义 CPP 设计空间。特别是，它们可以提供 CPP 对产品 CQA 影响的因果理解，这对于 QbD 框架至关重要。

灌装/完成和超滤/洗滤 (UF/DF) 步骤通常被发现是功能性 AAV 滴度损失的主要原因，因此 USD 可能用于确定这些损失的原因。这种损失被认为源于浓缩步骤中剪切诱导的病毒聚集。然而，虽然 UF/DF 和灌装/完成步骤因泵和阀门中的微空化，是生物工艺中剪切应力的两个主要来源，但需要进一步研究，以确认剪切应力是 AAV 损失的主要原因。治疗性蛋白质就是这种情况，其中聚集不仅归因于剪切应力，还在于暴露于气-液界面或在层析纯化步骤期间吸附到固体表面相结合，或者通过泵和阀门中的高剪切率引起的空化现象。此外，发现溶液的 pH 值和固-液界面的固体表面粗糙度会影响剪切应力下蛋白质聚集的程度。

最近的一项USD研究描述了 UF/DF 期间蛋白质浓度、剪切速率和跨膜压力对滤液通量和 mAb 聚集的影响。与中试规模过滤实验的比较表明，测试条件与滤液通量之间存在类似的相关性。发现增加的过滤时间和产品浓度与 USD 和中试规模 UF/DF 模型中的浊度增加相关，表明提高蛋白质浓度导致更频繁的蛋白质碰撞、更高的聚集倾向以及相应更高的浊度。尽管两个模型中的滤液通量之间有很好的一致性，但两个模型之间剪切暴露程度的差异导致检测到的浊度存在轻微差异。因此，需要进一步修改，以使 USD 更准确地模拟 UF/DF 中剪切应力的影响。在另一项研究中，USD 模型准确预测了离心过程中剪切应力对质粒 DNA 的影响。

迄今为止，USD 模型已经成功地模拟了许多生物制品的大规模生物工艺条件，包括质粒 DNA、单克隆抗体、腺病毒和细胞。然而，还没有文献报道使用 USD 模型来预测 AAV 在剪切应力下的行为。

原文：Z.Jiang, P.A.Dalby, Challenges in scaling up AAV-based gene therapy manufacturing. Trends in Biotechnology, 2023.