大规模 AAV 生产
大规模生产和商业化生产需要特定的细胞系特性，例如可放大性和高产量。细胞需要在低成本、无血清的培养基中生长，系统应该符合纯度和安全的监管要求。传统上，基于悬浮的生产是在体积高达 50,000 L 的可重复使用不锈钢生物反应器 (STR) 或 15 mL - 2,000 L 规模的一次性 STR 中进行的。STR 非常灵活，可提供广泛的潜在操作条件以及基于充分理解的混合原理的高效气体传输。
摇摆式生物反应器也可用于规模高达 500 L 的悬浮培养。与 STR 不同，这些系统的可放大性有限，因为它们仅使用顶空通气，但系统易于操作。例如，可实现的体积可用于中等规模的生产，作为大规模细胞生产的种子扩增系列的一部分，以及用于生产（辅助）病毒种子储备。这种悬浮培养中的细胞基质在数千升的批次生产中显示出遗传稳定性。
STR 中达到的细胞密度取决于细胞类型和培养基，但对于没有细胞截留的批次培养，通常范围在 5 - 20 × 10^6 cells/mL 之间。适用于 STR 和摇摆系统的灌流模式培养技术可以通过将细胞维持在最佳代谢状态来增加细胞密度。例如，通过在线生物量测量和灌流速率控制，中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞的密度已达到 100 × 10^6 cells/mL。为了保持活性生物量，生物反应器必须配备截留装置，使其能够以灌流模式运行培养。
如此高的细胞密度有助于在产品生产开始之前缩短细胞扩增轨迹。以更快的速度达到这些密度可以减少 GMP 生产设施内用于细胞扩增所需的时间和材料。此外，在基于病毒感染的生产系统中支持高细胞密度的能力为基于感染时细胞密度增加的工艺优化和强化创造了机会。如果工艺工程师能够保持细胞特异性生产率，那么感染时这种更高的密度将提供更高的单位体积生产率。
昆虫细胞和悬浮驯化的 HEK293 细胞等悬浮细胞系可以在摇摆式反应器和搅拌罐反应器中使用无血清、化学成分确定的培养基生长，使其适用于 AAV 的大规模生产和商业化生产。Merten 对不同上游 AAV 生产系统的输出进行了全面的、基于文献的比较，并得出结论，血清型和载体结构的差异阻碍了真正的比较 - 但原则上，不同的生产系统都可以实现 5 × 10^13 至 2.4 × 10^14 vg/L。然而，使用基于 HEK293 转染的工艺需要大量昂贵（高质量、符合 GMP 标准）的质粒和转染试剂。
在 2019 年的一份成本比较报告中，Cameau 等人显示每克质粒 DNA 的成本为100,000 美元（定价基于 GMP 级质粒的大批量订单）。在他们的模型中，作者假设在 HEK293 悬浮培养中转染 10^6 cells以生产 AAV，需要 1.5 µg 质粒 DNA，在 10^6 cells/mL 的转染密度下，每生产 2,000 L，质粒 DNA 需要投资 300,000 美元。用于病毒载体生产的、广泛使用的基于 HEK293 的瞬时转染工艺很容易在实验室规模上执行，但其具有挑战性的过程控制和可变性可能会在放大过程中造成困难。
BEVS 生产系统已经使用了几十年，从传统的研究工具发展成为兽药产品的生产系统，然后是用于生产人类治疗药物的生产技术。使用该系统的昆虫细胞生产了多种供人类使用的许可疫苗和疗法。其中包括 uniQure 的 Glybera 疗法，它在 2012 年成为第一个获得上市许可的基因疗法，以及 2021 年的 COVID-19 疫苗。这样的记录证明，如果杆状病毒在多个传代中针对遗传稳定性进行了优化，那么真正的BEVS 生产系统可以实现规模化生产。
例如，源于 S. frugiperda 的细胞系 - Protein Sciences Corporation 的 expressSF+ 细胞系 - 已被用于 Flublok 生产过程中的快速高效放大。有了它，公司在 2-L、10-L、100-L、650-L 和 2,500-L 规模上实现了相同的工艺性能，然后进一步扩大到 21,000-L 生产工艺。BEVS 使用标准化和完全表征的杆状病毒种子库来实现一致的上游生产。与 HEK293 转染工艺相比，Sf9 细胞的感染不需要仔细的混合控制。在生产过程中，携带产生重组 AAV 载体所需基因的杆状病毒被添加到生产生物反应器中以感染 Sf9 细胞培养。该方法最大限度地减少了对培养系统的负面影响（来自治疗性转基因的表达），因为 AAV 载体中通常使用的哺乳动物启动子在昆虫细胞中很少或没有表达。
与 AAV 生产相关的挑战包括生产过程的稳健性低、AAV 滴度的高可变性以及含基因组颗粒的百分比低/可变。上游工艺的一致性对于使下游生产工艺能够提供正确且一致的产品质量和产量至关重要。AAV 的大规模生产必须去除无法有效放大的下游技术：例如，离心和梯度超速离心。过滤和层析技术是优选。
AAV 生产下游工艺的一个关键挑战是解决和控制空衣壳和完整衣壳的混合物，空衣壳被认为是工艺相关杂质。为此，重要的是在上游产生尽可能高的完整/空衣壳比，从而简化随后使用离子交换层析 (IEX) 在下游工艺中去除空衣壳的过程。它根据颗粒净表面电荷的相应差异来分离颗粒，对于 AAV，净表面电荷根据其等电点 (pI) 和环境 pH 值可以是正、中或负的。可以使用多种层析载体，包括膜层析（例如 Pall 的 Mustang S 型）、固定整体柱形式的对流相互作用介质（来自 Sartorius BIA Separations 的 CIM）或基于颗粒的吸附层析（Cytiva 的 Sepharose 填料和 Thermo Fisher Scientific 的 POROS介质）。
许多 AAV 血清型的 pI 已经确定，完整 AAV 衣壳的 pI 略低于空衣壳，因为衣壳结构中的 DNA 带负电荷。尽管 pI 值差异很小，但 IEX 可以通过优化的洗脱条件将它们分离。基于 IEX 的工艺是可重复的，可以自动化并适应满足工业生产需求的大规模操作。然而，通常需要对 IEX 方法进行实质性开发，因为分离空颗粒和完整颗粒的条件取决于它们在衣壳和包壳病毒基因组之间的物理化学相互作用。
AAV 生产的监管注意事项
基因治疗开发人员非常感兴趣的是加速批准途径。美国食品和药物管理局 (FDA) 的加速批准范例可以近似为四年时间框架，而不是产品批准的典型 10-11 年 - 如果许可申请的化学、制造和控制 (CMC) 部分足够稳健，并且如果精心设计的早期临床研究已证明其有效性。对于希望利用这种范例的公司，必须投资于商业就绪生产平台的早期开发，这些平台使用可以迅速扩大到商业生产的工艺，尽快为 CMC 文件包生成可靠的数据。
尽管 BEVS 平台需要在时间和资源上进行前期投资，来生产和表征高质量的杆状病毒种子库，但可通过快速和线性的放大轨迹来平衡这一点，并在工艺和其生物起始材料方面保持一致。在临床开发或大规模 GMP 生产期间对基于 BEVS 的生物生产工艺进行重大变更是一种潜在的策略，可能会带来重大的技术和监管挑战并延迟项目。从一个高效、稳健和可放大的生产平台开始，开发具有成本效益的生产工艺对于满足未来的治疗需求将变得越来越重要。
商品成本是关键
据估计，到 2025 年全球基因治疗市场价值将超过 100 亿美元。这种增长提供的机会导致开发用于临床应用的 AAV 载体的公司数量显著增加，正在进行的 AAV 临床试验超过 250 项。对临床前和临床病毒载体生产能力的需求正在增加，以支持越来越多的基因治疗开发项目。下一代 AAV 生产系统将需要生产足够数量的治疗载体。每个生物生产商都应谨慎选择能够满足其自身临床和商业需求的生产系统。
基于转染的生产平台将为相对低剂量的孤儿病适应症提供足够的产量（例如，Luxturna 治疗眼病）。然而，随着基因治疗领域转变为一个为更多患者群体服务的行业，其载体需要系统给药，以应对越来越多的疾病适应症，生产能力估计需要增加一到两个数量级。
一旦 BEVS 在分子和工艺水平上得到适当设计，昆虫细胞系统就具有明显的潜力，可以提供具有有利商品成本 (CoG) 的先进 AAV 生产系统。这将有助于该行业解决对病毒载体不断增长的需求。
原文：F.Hoeksema, H.van der Schaar, P.Puri, et al., Large-Scale AAV Production: Advantages of an Insect-Cell Baculovirus Expression Vector Platform. Bioprocess Insider, 2023.
