rAAV 的生产是一个复杂的生物过程
重组腺相关病毒 (rAAV) 已成为体内基因治疗的首选载体。这些载体可用于转导哺乳动物细胞，从而实现稳定的游离基因维持和转基因表达。重组 AAV 是一种无复制能力的病毒载体，可通过以下几种方法之一产生：昆虫细胞的杆状病毒转导、哺乳动物细胞基于辅助病毒（如单纯疱疹病毒）的转染以及或哺乳动物细胞的三质粒瞬时转染。最近，稳定的生产细胞系变得更加受人关注，例如 CEVEC/Cytiva 的 ELEVECTA 平台，因为这些平台具有可放大性并减少了质粒 DNA 等昂贵原材料的需求量。此外，也存在质粒 DNA 的替代品：“狗骨”DNA (dbDNA) 是一种合成 DNA 载体，使用酶促 DNA 制造工艺生产，完全不需要微生物培养。
使用质粒 DNA 对悬浮驯化的 HEK293 细胞进行三质粒瞬时转染是生产 AAV 的最常用方法之一。此过程不依赖于辅助病毒，质粒 (pHelper) 提供必要的辅助元件。目的基因位于两个反向末端重复 (ITR) 序列 (pGOI) 和提供复制和衣壳蛋白 (pRepCap) 的第三个质粒之间的单独质粒上。HEK293 细胞系由于易于培养和转染而被广泛使用，它也是一种表征良好的细胞系，自 1977 年细胞系永生化以来一直用于生产重组蛋白。HEK293 细胞还稳定表达腺病毒 E1A 和E1B，两者都是 AAV 复制所必需的。
转染试剂，如聚乙烯亚胺 (PEI) ，有助于质粒进入细胞。PEI 与质粒 DNA 形成复合物，并在与细胞孵育期间通过静电相互作用与细胞膜结合。这些复合物然后通过胞吞作用以核内体的形式内化。核内体必须通过微管相互作用通过细胞骨架网络，避免溶酶体降解，直到质粒 DNA 从核内体逃逸到细胞质中，然后必须通过核孔复合体 (NPC) 进入细胞核。DNA 进入细胞核取决于细胞周期，有人建议接近 M 期的转染是理想的，因为核膜破裂可以增加质粒进入细胞核。
三质粒瞬时转染的优化工作已实现了收获后滴度增加，但对于全身给药药物的生产，目前的滴度仍然不够，因为可能需要超过 10^15vg/患者的剂量。最简单的方法是扩大生产规模，以满足行业需求，但这会对本已昂贵的疗法的商品成本产生巨大影响。在转染优化之前可以采取一些步骤来优化生产过程，其中最基本的是选择和开发合适的细胞系。细胞系选择将决定贴壁或悬浮培养细胞的上游工艺。一旦选择，就可以进行进一步的开发，例如对高性能克隆的克隆筛选。细胞系工程也可用于敲入或敲除特定基因以提高细胞系性能。质粒工程也可以在这一点上进行，以增加生产的完整衣壳的比例。质粒工程的潜在目标可能包括修改 ITR 以增加完整的目的基因 (GOI) 包裹，或修改 Rep 蛋白以尝试增加 GOI 的基因组复制和包装。
基于 HEK293 的系统的一个关键挑战是确保正确转染。据报道，只有 5-10% 的细胞似乎会产生可测量水平的 AAV 衣壳，这表明确保将每种质粒转染到每个细胞中可能是一个需要克服的障碍。这也可能是由抗病毒和炎症反应的诱导引起的，据报道这是对宿主细胞中 rAAV 产生的反应，通过降低或消除细胞对病毒产生的反应能力来影响这些途径也可能提供增加病毒滴度的机会。在细胞培养物中添加小分子抑制剂可以实现这一点，尽管可能需要在下游工艺 (DSP) 过程中去除这些小分子、或通过细胞系工程来敲除或敲低相关通路时产生问题。
随着规模的增加，转染过程变得更具挑战性，由于病毒载体生产设施越来越频繁地设计为大于或等于 2000 L 的规模，这一点变得越来越重要。
DoE 与 OFAT 方法
优化转染的一个关键步骤是确定过程中的关键因素。从转染试剂、质粒、细胞系和复合介质等原材料，到复合时间、质粒比例和所用 DNA 总量等因素，这些因素各不相同。在更大的规模下，其它因素开始发挥作用，例如转染混合物在反应容器内的分散所需的时间和效率。在初始工艺开发活动中可能不会考虑这些因素，因为这些工作通常以小得多的量进行。它们还会受到反应器形状、体积以及叶轮形状和速度等变量的影响。
如上所述，影响 rAAV 生产转染效率的因素有很多。一个常见的优化过程是一次修改一个因素 (OFAT) - 但是，这这没有考虑正在研究的因素之间的相互作用。Zhao等报道，OFAT 方法提高了某一血清型 rAAV 的产量，但在生产其它血清型时未观察到这种增加。
实验设计 (DoE) 是一种已成功用于优化整个生物技术行业流程的方法。DoE 允许对指定输出的多个相互依赖的因素进行评估。2020年，Zhao 等人首次报道了使用 DoE 优化 AAV 载体生产。质粒比率、总 DNA 浓度和细胞密度在 52 种不同条件下同时变化，导致 13 种不同衣壳变体的平均纯化后产量超过 1×10^14 vg/L。诸如此类的结果可以用作进入管线的新项目或产品的优秀基准，因此在这些情况下，减少工艺开发可能是可以接受的，而无需从第一原则开始重复完整的 DoE 流程。
使用 DoE 优化转染通常会涉及几轮实验。第一轮可能会查看更大范围的几个变量，例如转染时的活细胞密度、DNA 浓度、转染试剂：DNA 比率、转染体积和复合物形成的孵育时间。在此之后，可能会进行另一个 DoE 以进一步细化这些因素，或者可能会引入新的变量，例如质粒比率。在引入新的原材料、评估新的转染试剂或使用新的细胞系时，有必要重复这些 DoE。
近年来，已经投入了更多资源来了解 AAV 生产的基本原理，包括野生型和重组型。已经有文章回顾了生产 AAV 的 HEK293 细胞的蛋白质组学，并有文章总结了 AAV 产生的细胞途径和动力学，以及通过三质粒转染 HEK293 细胞开发 rAAV 生产的机制模型。这种对细胞过程和动力学的更深入理解允许更有针对性的工艺优化。这方面的一个例子是利用 PEI 介导的质粒 DNA 传递的机制模型，该模型表明只有 5% 的质粒输入进入细胞，而进入细胞核的量甚至更小，约为 0.6%。这些数字可能因细胞系和转染试剂而异，但确实提供了在尝试优化瞬时表达工艺中最关键的部分时需要克服的障碍。
优化转染是关键步骤，但不是唯一步骤
使用基于质粒的瞬时表达系统时，优化的转染工艺对于确保最佳产量、质量和一致性至关重要。将所有必需的质粒 DNA 输送到细胞核的过程是成功开发高产生产平台的基础。
为了最大限度地提高生产率，还需要评估其它因素。这些范围从细胞系开发、细胞系的组学评估以确定基因敲除或敲低的目标，以及质粒工程以最大化完整衣壳，到生产过程中的培养基成分和补液策略以优化细胞健康和生产力。所有这些因素和许多其它因素都有助于生产过程足以满足当前一代基因疗法开发的需要。
原文：P. Boyce, Transfection optimization for AAV production. Cell & Gene Therapy Insights 2023; 9(3), 305–309.
