基于先进技术的优化策略对于最大化产量和质量至关重要。
贴壁细胞培养至少在小规模上被广泛用于生产许多下一代疗法，包括用于基因和基因修饰细胞疗法的病毒载体以及非基因修饰的细胞疗法。随着对这些先进药物的需求迅速增加，需要克服贴壁生产过程的横向扩展和放大的挑战，包括细胞收获步骤 - 无论细胞是被丢弃还是作为产品收集。
许多不同的贴壁方法和产品类型
FUJIFILM Diosynth Biotechnologies 的项目设计和全球分析策略组的项目设计总监 Ian Goodwin 表示，用于生产生物制药产品的贴壁细胞培养可以通过多种方式用于许多不同类型的生物制品。单克隆抗体 (mAb)、重组蛋白和大多数病毒载体在悬浮培养中生长，通常不需要收集细胞。对于分泌到培养基中的产物，收集上清液并丢弃细胞。如果产物不被分泌或既被内化又被分泌，则必须首先裂解细胞、以释放产物，然后收集裂解物。在这两种情况下，收集的生物工艺流体都经过过滤，通常是深层过滤，然后是除菌过滤。
顾名思义，贴壁细胞需要它们可以附着的基质或支架。在小规模条件下，平面系统提供了相关的表面。在更大规模上，固定床生物反应器提供了支持。如果倾向于悬浮样条件，可以使用微载体或由各种合成材料组成的基球作为细胞结合的表面。
两种主要的收获方法
无论用于支持贴壁细胞的方法和工艺的规模如何，细胞都必须与其支持物分离。Univercells Technologies 产品经理 Clément Dumont 表示，通用原则适用于不同应用的所有细胞分离操作。“无论细胞是用于生产生物制品还是直接用作最终产品，分离过程都将涉及将细胞暴露于酶促和潜在的机械作用。该过程的特殊性将取决于不同的考虑因素，主要是细胞的类型、它们的预期用途以及操作执行的规模，”他解释道。
例如，用于小规模研发实验的 T 瓶中的人胚肾 293 (HEK293) 细胞培养通常可以通过遵循一系列简单的操作来分离：移除培养基，添加分离酶并孵育，然后收集细胞，Dumont 说。典型的酶包括胰蛋白酶或 Accutase (Invitrogen)。在传代步骤中，通常通过手动摇动烧瓶（机械作用）来辅助细胞收集。
对于大多数大规模、基于多层培养器皿的工艺，通常采用酶促收获。Samsung Biologics 制造、科学和技术上游工艺团队的首席科学家 Lee Seung-sun 指出，由于物理方法不适用，因此这种方法还用于从微载体和固定床生物反应器中去除贴壁细胞。“在收集用作细胞疗法的细胞时必须特别小心，以避免损坏细胞膜和细胞外基质，即使在使用酶促工艺时也是如此，因为某些酶会降解这些重要的细胞特征，”他补充道。
然而，当放大规模时，必须复制与研发规模相同的行动，但表面积要大得多。Dumont表示，这会增加复杂性。“例如，从 40 层细胞工厂 (CF40) 中分离细胞可能需要专门的设备来处理流体和容器或施加机械作用。当涉及大量容器时，这些特殊要求可能变得不切实际，”他争辩道。
微载体呈现出不同的情况。“细胞和微载体可能经过化学处理，如果微载体不溶，混合物会通过筛网分离细胞。如果微载体可以用果胶酶溶解，用这种酶处理可以释放细胞进行进一步工艺处理，”FUJIFILM Diosynth Biotechnologies 病毒基因治疗工艺开发高级总监 Michael Baker 观察到。
根据 Goodwin 的说法，在某些情况下，细胞疗法在类似贴壁的条件下生长，但细胞附着有些松散，从而无需使用解离试剂。他还强调，随着项目从临床前阶段进入商业阶段或规模，关键工艺参数和细胞收获的设计空间可能会发生变化；即便如此，Goodwin 建议尽可能避免对收获方法进行任何更改。
规模扩展的挑战
需要贴壁培养的细胞类型在规模放大和收获方面遇到挑战，而这些可能不会影响悬浮培养。鉴于可以在平面器皿中进行贴壁细胞培养的最大规模是有限的，因此需要横向规模扩展而不是放大来生产更大的产品数量，特别是对于表达型产品。Baker 评论道：“横向扩展的流程需要更多的劳动密集型工作，需要更多的空间、时间和人员，可能会危及产品质量。”
事实上，在扁平器皿中运行的细胞培养工艺无法实现自动化并且涉及大量手动操作，这也意味着制造商需要经验丰富且技术娴熟的细胞科学家，他们可以帮助减少复杂收获工艺实施过程中出错的可能性，Seung-sun称。
“目前，高效的培养容器无法用于贴壁细胞培养的生产和收获。虽然可以使用多层培养工厂，但它们存在一些限制，例如细胞增殖的最小表面积。由于缺乏高效的培养容器，收集此类细胞仍然需要 CO2 培养箱和人工操作的帮助，”Seung-sun 补充道。
Seung-sun 继续指出，值得注意的是，当前制造的大多数细胞治疗产品（即嵌合抗原受体 T 细胞、间充质干细胞）都是自体的、针对患者的疗法，可以小规模生产。此外，Baker 指出，使用贴壁细胞培养产生的许多治疗方法都针对极罕见的适应症，在这些适应症中，商业规模生产不需要显著扩大规模，因此，2D培养方式可能是生产药物底物的可行方式。
同样，典型细胞治疗应用所需的细胞数量低于生产其它生物药所需的细胞数量。根据 Goodwin 的说法，对于这些产品，挑战就变成了需要在封闭的一次性系统中生产它们，以最大限度地减少生产过程的无菌性挑战并降低污染风险。
规模放大的阻碍
虽然自体细胞疗法在当今市场占据主导地位，但许多候选药物都是同种异体或供体来源的。因此，Seung-sun 认为，有效扩大贴壁细胞培养工艺的能力对于未来细胞疗法的商业化至关重要。
对于确实需要规模放大的工艺，Baker指出，固定床生物反应器试图通过使用有利于细胞生长的复杂纤维基质或支架将表面积集中到一个单元中来克服放大问题。同时，微载体可以使用搅拌罐反应器和类似悬浮培养的条件。“这些属性使 3D 反应器和微载体成为贴壁细胞系产品的良好选择，这些产品旨在治疗更大的患者群体和/或需要更大体积的细胞，”他总结道。
然而，规模放大并非没有问题。表达在贴壁细胞内部的产物需要细胞收集。Baker 表示，在孔板和培养皿等非常小规模的环境中，可以对细胞进行机械操作（刮擦）并以非常高的效率进行收集。
较大的固定床生物反应器也必须接种细胞。对于种子扩增链操作，Dumont 强调，生成足够的细胞数量所需的扁平器皿单元数量不断增加，这造成了操作限制。“需要大型设备和相关劳动力来操纵大量装置，导致大量 CAPEX [资本支出] 和 OPEX [运营费用]，同时还需要更多手动（非自动）操作，这会增加污染风险和低再现性，“ 他说。大收获体积也可能是一个挑战。“在下一步之前可能需要进一步处理和浓缩细胞，这对于种子培养操作来说尤其成问题，因为在整个过程中需要多次传代，”Dumont 评论道。
Dumont 表示，与此同时，使用微载体的工艺可能难以转移，而且往往需要更多优化才能在大规模条件下实现合适的工艺。“剪切应力和基球聚集是需要解决的常见缺点。这些生物反应器的体积很大，导致占地面积也很大，”他说。
此外，Baker 观察到，化学释放剂必须从最终产品基质中去除，因为它们被认为是与工艺相关的杂质。他还指出，当使用微载体在悬浮体系中培养贴壁细胞时，还应考虑溶解微载体或提取微载体的溶出 & 析出问题。
最后，Seung-sun 指出，目前的固定床生物反应器较难对细胞进行取样并获得有关细胞状况、代谢变化或活细胞数量的直接分析数据。“充其量，可以根据培养基中的葡萄糖浓度来估计活细胞的数量，”他解释道。
一些优化策略
贴壁细胞培养工艺的几乎所有方面都可以通过某种方式进行优化。首先，根据 Dumont 的说法，可以优化分离过程，以考虑具有不同属性和行为特征的不同类型的细胞，这些细胞在脆弱性/抗降解、聚集等方面具有不同的特性和行为特征。这种优化将导致对酶、孵育时间和机械作用水平的不同选择。“选择用于将该工艺过程工业化的技术至关重要。需要在快速且简单的操作与适应各种工艺类型的灵活性之间找到良好的平衡，”他说。
Seung-sun 观察到，优化用于细胞分离的酶处理工艺的条件也是一个重要的策略。“研究浓度、时间和温度，以及最大化培养容器与酶的接触面积，有助于最大限度地减少细胞损伤并提高收获收率，”他说。Goodwin 补充说，实验设计方法有利于优化细胞裂解和去除裂解试剂（通过各种纯化步骤）。
对于作为治疗产品的细胞，除了使用封闭环境来确保无菌性和降低污染风险之外，Goodwin 观察到任何破坏细胞附着的过程都必须针对细胞的释放进行优化，同时最大限度地减少结构完整性受损的细胞，这可能会影响细胞治疗产品的功效、效力和/或安全性。
技术发展的帮助
生物制药行业虽然保守，但在创新方面有其基础。细胞收获操作受益于不断提高性能和降低生物药生产成本的行业趋势。Baker 表示，新的化学解离试剂和物理分离方法不断被开发和推出，以帮助研究人员改进细胞收获程序。他补充说，最近还引入了平皿自动化程序，可以将细胞培养和细胞收获步骤的劳动密集型程序减少 30-50%。
Seung-sun 重点介绍了新的培养设备，例如 Wilson Wolf 的 G-Rex、Terumo 的 Quantum、Lonza 的 Cocoon 和 Miltenyi Biotech 的 CliniMACS 系统，但他确实指出，大多数这些“cell-therapy-in-a-box”解决方案都设计用于支持悬浮细胞培养。与此同时，Univercells Technologies 专注于通过能够实现工艺强化和链接化的技术，来改进病毒载体的生产。
Dumont 指出，该公司最近的工作是开发了一种有效的解决方案，用于从其台式规模的 scale-X 固定床生物反应器中收获细胞，以支持优化的种子培养。“台式 scale-X 细胞收获模块允许在固定床生物反应器中强化细胞生长，显著提高工艺强化，减少占地面积和所需的操作，”他说。Dumont 表示，机械作用可提供高细胞收获率（高达 2.1x10^9 cells/m2）和出色的活性 (>90%)。“自动控制系统支持可配置的收获方案，预消毒的封闭系统降低了与平皿系统相关的可重复性和无菌风险问题，同时还降低了材料和人工成本，”他补充道。
未来的希望是实现封闭、自动化工艺
最后，Dumont 强调，成功的细胞收获取决于特定的工艺和为该工艺的工业化而选择的技术。“生产平台需要支持快速和简单的操作，同时提供适应各种工艺类型的灵活性，”他说。
预计技术将继续进步。Goodwin 指出了改进的细胞收获解决方案，可以最大限度地提高细胞回收率，尤其是在封闭系统中。“要么细胞收获程序将继续发展、以支持大规模工艺，要么培养容器将专门针对细胞收获目的而进行设计，”他评论道。
Goodwin 表示，向封闭系统的转变将继续，自动化控制的采用也将增加 - 这既是为了减少操作员错误和污染的风险，也是为了最大限度地减少生产批次之间的操作差异。他说，这些进步也将有助于降低生产成本。
另外，Seung-sun 预计细胞治疗市场将逐渐转向悬浮细胞培养。“与悬浮培养相比，贴壁细胞培养效率低得多。工业生物药生产方面取得的进展为下一代治疗产品的类似改进提供了动力，”他说。一项可能促进这种转变的技术是一次性 3D 垂直轮生物反应器，Goodwin 指出，该技术已被证明可成功用于将贴壁细胞转化为悬浮生长模式，使用或不使用微载体。
Dumont 表示同意，摆脱横向规模扩展的手动细胞培养和收获将从根本上改变此类操作的范式。“为细胞培养和收获选择一个封闭、自动化的解决方案可以降低操作风险并显著降低成本。最终，这将提高行业的质量和成本效益，”他总结道。
总的来说，Baker坚持认为应该强调前瞻性、可扩展的选择。“对于生物制药和细胞治疗应用，贴壁或贴壁样培养应使用减少无菌边界的技术，并结合最新的生产污染控制策略。紧跟行业趋势和技术发展将带来更多的生产批次成功（更少的损失），通过自动化实现更高效的运营，并减少对产品完整性的安全担忧，”他总结道。
原文：Challener, C. Overcoming Harvesting Challenges for Adherent Cell-Culture Processes. BioPharm International 2023 36 (5).
